Однонуклеотидные полиморфизмы как маркеры индивидуальной реакции на хроническое радиационное воздействие

ОДНОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПОЛИМОРФИЗМЫ КАК МАРКЕРЫ

ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ НА ХРОНИЧЕСКОЕ РАДИАЦИОННОЕ

ВОЗДЕЙСТВИЕ

 

Уткин К.В., Кофиади И.А., Алексеев Л.П., Абрамов Д.Д., Батенева Е.И., Хаитов P.M., академик РАН (ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России),

Веремеева Г.А., Площанская О.Г.,  Аклеев А.В. (ФГУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины» ФМБА России),

Киселев М.Ф. (ФМБА России)

 

Преамбула рецензента

В публикуемой ниже статье рассматриваются  вопросы радиобиологии и медицинской генетики. Она содержит  результаты исследований, направленных на выявление индивидуальных генетических различий внутри относительно однородной популяции, определяющих фенотипически проявляемую повышенную радиорезистентность. Тем не менее, статья может представлять определенный  интерес для постоянных читателей нашего журнала, поскольку продолжение выполненных исследований в перспективе может принести конкретные  практические результаты в вопросах обеспечения радиационной безопасности человека. Если вышеупомянутые установленные различия в аллелях одного и того же гена человека допускают инструментальную идентификацию (т. е. могут быть использованы как генетические маркеры), то в отдаленной перспективе их в принципе можно будет использовать для выявления индивидуумов, ткани которых  характеризуются повышенной устойчивостью к хроническому облучению с точки зрения вероятности отдаленных стохастических эффектов облучения (прежде всего возникновения злокачественных новообразований).  О генетически обусловленных различиях индивидуальной радиочувствительности по отношению к детерминированным эффектам облучения в статье речь не идет.

Безусловно, консервативно установленные единые критерии радиационной безопасности никогда не будут меняться в зависимости  от генотипа конкретного индивидуума. Однако для оптимизации мониторинга состояния здоровья лиц, получавших в прошлом повышенные дозы хронического облучения,  могут быть развиты индивидуальные подходы к диагностике его возможных последствий, использующие результаты исследований таких генетических маркеров. Эти результаты могли бы быть полезны также, например при планировании повышенного облучения персонала в соответствии с положениями НРБ-99/2009. Так, предварительная идентификация генетических маркеров лиц из персонала объектов использования атомной энергии могла быть использована для определения круга тех лиц, привлечение которых к ликвидации последствий возможных радиационных аварий на объекте было бы предпочтительным по сравнению со всеми остальными, давшими добровольное согласие на повышенное облучение. 

 Небольшие пояснения к тексту статьи, которые могут быть полезными читателю, заинтересовавшемуся рассматриваемой проблематикой. Полиморфизм – различие между двумя вариациями одного и того же гена, отвечающего в данной популяции за одну и ту же функцию (как правило, генерацию какого-либо белка). Эти вариации, так называемые аллели, определяются незначительными различиями генетического кода, такими, что это в целом не влияет на выполнение функции (обычно белки, кодируемые разными аллелями одного гена, обладают одинаковыми функциональными свойствами). Однонуклеотидный полиморфизм – наличие двух или более аллелей одного гена, отличающихся заменой только одного нуклеотида.

                                                           Строганов А.А., к. ф.-м. н.

 

Развитие атомной промышленности, а также методов радиационной медицины приводит к расширению сферы контактов человека с источниками радиации. Реакция тканей и организма в целом на радиационное воздействие обусловлена взаимодействием целого ряда клеточных и молекулярных факторов. При хроническом радиационном воздействии невысокой мощности реакция тканей на одинаковые дозы радиации, а также тяжесть негативных последствий облучения варьируются на индивидуальном уровне [1]. В связи с этим, востребована разработка новых технологий реабилитации хронически облучённых людей с использованием индивидуальных подходов к диагностике, оценке радиационных рисков и коррекции выявляемых нарушений.

Актуальность проблемы обусловлена, в частности, последствиями глобальных техногенных катастроф на атомных электростанциях в Чернобыле (Украина) и префектуре Фукусима (Япония), приведших к многочисленным жертвам среди населения и лиц, задействованных в ликвидации аварий.

Установлено, что ионизирующее излучение повышает риск развития злокачественных новообразований (ЗНО) [2, 3]. Риск развития онкологических заболеваний определяется действием многих факторов, как внешних, так и внутренних, обусловленных особенностями метаболизма и наследуемой (генетической) предрасположенностью к заболеванию.

Генетическая составляющая играет важную роль в развитии всех мультифакториальных заболеваний. Так, например, возникновение ЗНО, в среднем, на 30% обусловлено влиянием полиморфизма генов [4], а в случае с аутоиммунными нарушениями этот показатель достигает 5060% [5]. Это позволяет предположить влияние генотипа на риск возникновения отдалённых эффектов облучения, прежде всего, онкопатологии.

В ходе изучения динамики апоптоза облученных культур CD8+ лимфоцитов, а также по результатам исследований экспрессии генов в группах пациентов с выраженной реакцией на радиационное воздействие было установлено, что основные гены, определяющие радиочувствительность, относятся к системам репарации ДНК, апоптоза и окислительного стресса [6,7]. Полиморфизм этих генов может быть причиной структурно-функциональных изменений белков, а это, в свою очередь, может приводить к отличиям в реакции тканей на облучение. Исходя из этого, нами были разработаны тест-системы для определения кандидатных генетических маркеров, ассоциированных с риском развития отдалённых последствий облучения. На сегодняшний день наиболее удобным маркером с точки зрения технологии и стоимости анализа являются однонуклеотидные полиморфизмы или SNP (Single Nucleotide Polymorphism). Часто SNP не связаны с признаком напрямую, однако плотность их распределения в геноме (примерно 1 на 300 п.н.) позволяет отобрать те из них, которые расположены вблизи от генетической вариации, непосредственно влияющей на свойства продукта гена, и наследуются вместе с ней в составе единого локуса. Кроме того, SNP эволюционно стабильны, широко распространены и почти всегда биаллельны, что позволяет легко адаптировать технологию генотипирования к использованию в лечебных учреждениях и диагностических центрах.

В панель кандидатных маркеров вошли пять SNP, расположенных в генах ATM, TGFB1, XRCC1, OGG1, а также четыре маркера, расположенных в интроне 8q24 на 8 хромосоме. Выбор кандидатных генов и SNP в них основан на полученных ранее результатах, демонстрирующих достоверную ассоциацию маркеров, расположенных в этих генах с различными клиническими симптомами, обусловленными облучением и, в частности, с повышенным риском развития онкологических заболеваний [8, 9].

Целью исследования стала оценка ассоциации кандидатных SNP-маркеров с формированием фенотипа, характеризующегося повышенной устойчивостью тканей к хроническому облучению. С помощью разработанных тест-систем были определены частоты встречаемости кандидатных SNP-маркеров в группе устойчивых к радиационному воздействию пациентов относительно популяционного контроля.

Материалы и методика

Образцы

Было обследовано 130 человек. Первую группу (основная группа - Е) составили 30 образцов геномной ДНК из коллекции Уральского научно-практического центра радиационной медицины, полученных от неродственных пациентов жителей прибрежных сёл р. Теча, подвергшихся длительному комбинированному облучению: внешнему g-облучению и внутреннему, обусловленному инкорпорацией 90Sr в костную ткань. Медиана накопленной дозы на красный костный мозг составляет 1,23 Зв. Выборка включает представителей русской популяции, а также объединенной группы татарской и башкирской популяций тюркской ветви алтайской языковой семьи (5 и 25 человек, соответственно) 1933-1949 года рождения. Обследованные лица не имели серьёзной соматической патологии. Во вторую группу (популяционный контроль Р) вошли образцы ДНК, полученные от 100 здоровых представителей русской популяции доноров первичной кроводачи из коллекции Института иммунологии ФМБА России. В состав группы вошли индивидуумы, проживающие на территории Центрального, Южного, Волжского, Уральского и Северного-западного федеральных округов РФ.

В качестве дополнительного межпопуляционного контроля использовали эталонные выборки из популяций европейского (CEU − 60 неродственных представителей) и азиатского (СНВ − 45 неродственных представителей) происхождения из базы данных НарМар Национального Центра Биотехнологической Информации США[1] (далее – НарМар).

Выбор генов

На основании полученных ранее экспериментальных данных [1013], а также результатов исследований, подтверждающих влияние полиморфизма генов на чувствительность тканей к радиационному воздействию [8, 9], были выбраны 5 кандидатных SNP-маркеров в четырех генах: ATM (2 маркера), TGFB1, XRCC1 и OGG1 (таблица). Серин-протеиновая киназа ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) принимает участие в фосфорилировании белков репарарации ДНК, регуляции механизма апоптоза в ответ на формирование двуцепочечных разрывов ДНК, а также в стабилизации супрессорного опухолевого белка р53. Трансформирующий фактор роста бета TGFB1 вовлечен в ответ клетки на стрессорное воздействие (цитотоксические препараты, ионизирующее излучение, температурный шок, окислительный стресс), а также является медиатором системы передачи сигнала между компонентами врожденного и приобретенного иммунитета (KEGG:hsa04010, hsa04060). Оба гена являются важными компонентами систем репарации ДНК и регуляции клеточного цикла, нарушения в которых связаны с процессом канцерогенеза (KEGG:hsa05200). Гены XRCC1 и OGG1 кодируют тесно связанные продукты, регулирующие процесс гомологичной рекомбинации и репарации одноцепочечных разрывов ДНК (KEGG:hsa03410).

Кроме того, мы включили в панель несколько маркеров, связанных с повышенным риском развития ЗНО, по результатам полногеномных ассоциативных исследований GWAS (Genome-Wide Association Study)[2]. Этот подход основан на статистической оценке ассоциации генотипа с признаком без учета экспериментальных данных. Было выбрано 4 маркера из региона 8q24 на 8 хромосоме, для которых установлена ассоциация с раком простаты, прямой кишки и молочной железы [14–17] (табл. 1). Все SNP-маркеры проверяли на независимое наследование с помощью базы НарМар.

Таблица

Кандидатные  SNP-маркеры, включенные в исследование

 

Маркер

Ген

Тест-система

rs 1801516

ATM

ATM16

rs 664677

ATM

ATM77

rs 1800469

TGFB1

TGF69

rs 1799782

XRCC1

XR82

rs 1052133

OGG1

OGG33

rs 9642880

8 q 24

8q80

rs 6983267

8 q 24

8q67

rs 1447295

8 q 24

8q95

rs 13281615

8 q 24

POU15

 

Генотипирование и статистическая обработка

Генотипирование проводили методом ПЦР в реальном времени с анализом температуры плавления аллель-специфичных проб по протоколу [18]. Все оборудование и реактивы, использованные в работе, были произведены ЗАО «НПФ ДНК-технология» (Россия). Дизайн праймеров и молекулярных проб осуществляли с помощью программы Oligo 6.0, а также базы данных dbSNP и алгоритма Blast Национального Центра Биотехнологической Информации США[3].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью критерия                          Х  2   ·  (P  <  0,05) .

Результаты

Распределение аллелей в европейской и азиатской популяции

относительно исследованных групп

Группа облучённых на р. Теча людей неоднородна по этническому составу. Большая часть группы (83%) представлена лицами тюркской этнической принадлежности (татары, башкиры). Чтобы исключить возможность отклонений, вызванных отличиями в распределении маркеров в различных популяциях, нами был проведен сравнительный анализ частот аллелей исследованных SNP в эталонных популяциях азиатского (СНВ) и европейского (CEU) происхождения, представленных в базе данных НарМар относительно выборки Р из русской популяции.

По результатам анализа большинство SNP-маркеров, за исключением                  rs 1052133 (ген OGG1), rs 1801516 (ген ATM) и rs 1799782 (ген XRCC1), попали в группу, характеризующуюся сходным распределением во всех трех группах сравнения. Таким образом, влияние фактора геномного разнообразия отдельных популяций, этносов, этнотерриториальных сообществ (популяционной стратификации) при исследовании маркеров, распределенных в выбранных группах равномерно, можно исключить. Отличия в частоте аллелей генов OGG1, ATM и XRCCl установлены только для групп Р и СНВ. В то же время, в группе Р и CEU указанные маркеры распределены одинаково (без статистически достоверных отличий) (рис. 1).

Рис. 1. Сравнительный анализ распределения аллелей в европейской (CEU) и азиатской (СНВ) популяции относительно группы популяционного контроля (выборка Р)

 

Распределение аллелей кандидатных SNP-маркеров                                                   в исследуемых группах

Из 9 SNP-маркеров, взятых в исследование, для трех (rs 1801516,               rs 664677, rs 1052133) в сравниваемых группах обнаружены отличия в распределении (рис. 2). Минорный аллель Т-варианта Asp 1853Asn гена ATM (rsl801516) встречается в основной группе (Е) достоверно реже относительно популяционного контроля (Р). В то же время, частота минорного аллеля Т-варианта IVS22-77  (rs 664677) того же гена в группе облучённых людей выше. Поскольку нами отбирались облучённые лица без отдалённой соматико-стохастической патологии, прожившие более 60 лет от начала облучения, мы рассматриваем их как группу радиорезистентных индивидуумов. Таким образом, можно предположить разнонаправленное влияние данных полиморфизмов на признак радиорезистентности. Еще одно достоверное отличие обнаружено для минорного аллеля G-варианта Ser 326Cys, расположенного в 326 кодоне гена OGG1 (rs 1052133). Наличие протективного эффекта для этого маркера описывалось ранее [9].

Рис. 2. Сравнительный анализ частот аллелей кандидатных

SNP-маркеров  в исследованных популяциях (Е-группа пациентов «устойчивых к радиовоздействию»,  Р-группа популяционного контроля)

 

 

 

Обсуждение

Полученные результаты позволяют говорить о возможном влиянии генетического фактора на формирование индивидуальной радиорезистентности. Исследованные SNP-маркеры (rs 1801516, rs 664677, rs 1052133) могут использоваться для оценки индивидуальной радиорезистентности/радиочувствительности при формировании групп риска отдалённой соматико-стохастической патологии. Конечно, размер выборки и отсутствие многих контрольных групп пациентов, которые могли бы дополнить существующую картину распределения аллелей, не позволяют на данном этапе исследования делать выводы об отсутствии ассоциации остальных маркеров с чувствительностью тканей к радиационному воздействию. Тем не менее, наличие достоверных отличий даже на уровне десятков образцов определяет целесообразность дальнейших исследований.

При проведении ассоциативных исследований необходимо учитывать отличия в распределении генетических маркеров в различных популяциях (фактор популяционнои стратификации). Частоты аллелей SNP-маркеров, по-разному представленных в популяциях европейского и азиатского региона, могут отличаться и в пределах популяционной системы населения России. Так, частота аллеля G в гене OGG1 варьируется от 0,22 среди европейцев до 0,55 в популяциях Китая и Японии. Другой маркер rs 1801516,  расположенный в гене АТМ (аллель А), практически не встречается в популяциях азиатского происхождения и, напротив, широко распространен в европейской этнической группе (0,19). Это может приводить к искажению результатов исследования. Однако  по данным о распределении SNP-маркеров в евроазиатском регионе генофонд популяций, проживающих на территории центральной части и Волго-Уральского региона России, в большей степени испытывает на себе влияние «притока генов» со стороны                        Европы [19].

Кроме того, исходя из результатов исследования полиморфизма генов системы HLA,  русские, татары и башкиры принадлежат одному этническому кластеру, что позволяет предположить сходное распределение эволюционно-стабильных независимых SNP-маркеров в этих популяциях [20]. Это дает основания к рассмотрению исследованных групп в составе общей по этнической принадлежности выборки и позволяет исключить влияние фактора популяционной стратификации на результат исследования.

Создание репрезентативной панели маркеров для оценки параметра индивидуальной генетически обусловленной радиочувствительности требует комплексного подхода. Недостаточно полные на сегодняшний день представления о степени меж- и внутрипопуляционной генетической вариабельности и об особенностях структурно-функциональной организации генома повышают вероятность установления ложных ассоциаций [21, 22]. Поэтому принципиальным является вопрос подбора групп пациентов, валидации ассоциаций и разработки эффективной модели дальнейших исследований.

 

Литература

 

1.    Crompton N.E., Shi Y.Q., Emery G.C, Wisser L., Blattmann H., Maier A., Li L., Schindler D., Ozsahin H., Ozsahin M. // Int. J. Radiat. Oncol. Biol.Phys. 2001. V. 49. № 2. P. 547–554.

2.    Upton A.C. // In Vivo. 2002. V. 16. № 6. P. 527–533.

3.    Аклеев А. В., Крестинина Л. Ю. // Вестник Российской академии медицинских наук. 2010. № 6. С. 34–39.

4.    Lichtenstein P., Holm N. V., Verkasalo P.K., Iliadou A., Kaprio J., Koskenvuo M., Pukkala E., Skytthe A., Hemminki K. // N. Engl. J. Med. 2000. V. 343.                    № 2. P. 7885.

5.    Redondo M.J., Yu L., Hawa M., Mackenzie Т., Руке D.A., Eisenbarth G.S., Leslie R.D. II Diabetologia. 2001. V. 44. № 3. P. 354362.

6.    Svensson J.P., Stalpers L.J., Esveldt-van Lange R.E., Franken N.A., Haveman J., Klein В., Turesson I, Vrieling H., Giphart-Gassler M. // PLoS Med. 2006. V. 3. № 10. С. 422.

7.    Ozsahin M., Crompton N.E., Gourgou S., Kramar A., Li L.r Shi Y., Sozzi W.I., Zouhair A., Mirimanoff R.O., Azria D. // Clin. Cancer. Res. 2005. V. 11. № 20.                             P. 74267433.

8.    Ho A. Y., Atencio D.P., Peters S., Stock R.G., Formenti S. C., Cesaretti J.A., Green S., Haffty В., Drumea K., Leitzin L., Kuten A., Azria D., Ozsahin M., Overgaard J., Andreassen C.N., Trop C.S., Park J., Rosenstein B.S. // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2006. V. 65. № 3, P. 646655.

9.    Агеева A.M., Гончарик O.O., Межерицкий С.А., Литвяков Н.В. // Сибирский онкологический журнал. 2010. Приложение № 1, С. 1113.

10. Andarawewa K.L., Paupert J., Pal A., Barcellos-Hoff M.H. // Int. J. Radiat. Biol. 2007. V. 83. № 1112. P. 803811.

11. Hyun J. W., Cheon G.J., Kim H.S., Lee Y.S., Choi E.Y., Yoon B.H, Kim J.S.,               Chung M.H. // Free. Radic. Biol. Med. 2002. V. 32. № 3. P. 212220.

12. Klising-Sireul E., Rigaud O., Ory K., Ugolin N., Lebeau J., Levalois C., Lectard B., Chevillard S. // J. Radiat. Res. (Tokyo). 2006. V. 47. № 3. P.  259272.

13.  Yacoub A., Park J.S., Qiao L., Dent P., Hagan M.P. // Int. J. Radiat. Biol. 2001.       V. 77. № 10. P. 10671078.

14.  Cortessis V.K., Yuan J.M., Van Den Berg D., Jiang X., Gago-Dominguez M., Stem M.C., Castelao J.E., Xiang Y.B., Gao Y.T, Pike M.C., Conti D. V. // Cancer Epidemio l. Biomarkers. Prev. 2010. V. 19. № 12. P. 31503156.

15.  Wokolorczyk D., Gliniewicz B., Sikorski A., Zlowocka K., Masojc В., Debniak T., Matyjasik J., Mierzejewski M., Medrek K., Oszutowska D., Suchy J., Gronwald J., Teodorczyk U., Huzarski T., Byrski Т., Jakubowska A., Gorski B., van de Wetering Т., Walczak S., Narod S.A., Lubinski J., Cybulski С. // Cancer Res. 2008. V. 68.    № 23.   P. 99829986.

16.  Yeager M., Orr N., Hayes R.B., Jacobs K.B., Kraft P., Wacholder S., Minichiello M.J., Fearnhead P., Yu K., Chatterjee N., Wang Z., Welch R., Staats B.J., Calle E.E., Feigelson H.S., Thun M.J., Rodriguez C., Albanes D., Virtamo J., Weinstein S., Schumacher F.R., Giovannucci E., Willett W.C., Cancel-Tassin G., Cussenot O., Valeri A., Andriole G.L., Gelmann E.P., Tucker M., Gerhard D.S., Fraumeni J.F. Jr., Hoover R., Hunter D.J., Chanock S.J., Thomas G. // Nat. Genet. 2007. V. 39. № 5.   P. 645649.

17.  Odefrey F., Stone J., Gurrin L. C., Byrnes G.B., Apicella C., Dite G.S., Cawson J.N., Giles G.G., Treloar S.A., English D.R., Hopper J.L., Southey M.C. // Cancer Res. 2010. V. 70. № 4. P. 14491458.

18.  Сергеев К.В., Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Абрамов Д.Д., Грудакова Е.Г., Гончарова Е.В., Алексеев Л.П. // Физиология и патология иммунной системы. 2009. Т. 13. № 4. С. 2125.

19.  Кофиади И.А., Кадочникова В.В., Абрамов Д.Д., Гончарова Е.В., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов P.M. // Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. 2011. Т. 15. № 2. С. 310.

20.  Болдырева М.Н., Гуськова И.А., Богатова О.В. // Иммунология. 2006. № 6.      С. 324329.

21.  Price A.L., Butler J., Patterson К., Capelli С., Pascali V.L., Scarnicci F., Ruiz-   Linares A., Groop L., Saetta A.A., Korkolopoulou P., Seligsohn U., Waliszewska A., Schirmer C., Ardlie K., Ramos A., Nemesh J., Arbeitman L., Goldstein D.B., Reich Д., Hirschhom J.N. // PLoS Genet. 2008. V. 4. № 1. С. 236.

22.  Sawyer S.L., Mukherjee N., Pakstis A.J., Feuk L., Kidd J.R., Brookes A.J.,         Kidd  K. K. // Eur. J. Hum. Genet. 2005. V. 13. № 5. P. 677686.



[1] Адрес в Интернете:  http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/

[2] Адрес в Интернете: www.genome.gov/gwastudies

[3] Адрес в Интернете: www.ncbi.nlm.nih.gov

ПРОТИВОДЕЙСТВИЕ КОРРУПЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ЗАДАНИЕ
НОРМАТИВНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ПРОДУКТЫ
КНИГИ

Для специалистов Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору предусмотрен особый порядок получения информационных ресурсов, выпускаемых ФБУ «НТЦ ЯРБ».

ПЕРСОНАЛЬНЫЙ КАБИНЕТ
регистрация

XIII Международный ядерный форум
 XIII Международный ядерный форум

Интерполитех-2018
interpolitex.jpg


ядерная и радиационная безопасность

Ежеквартальный научно-практический журнал
«Ядерная и радиационная безопасность»